PCR (Forschung) - Anwendung. Was ist die PCR-Technik?

PCR ist ein Test, der zur Diagnose vieler Krankheiten verwendet wurde. Die PCR-Methode ermöglicht es, das direkte Vorhandensein von Bakterien im Organismus und insbesondere seiner DNA zu zeigen. Unter anderem werden PCR-Tests eingesetzt bei der Diagnose der Lyme-Borreliose. Was ist die PCR-Technik? Was ist Echtzeit-PCR?

Inhaltsverzeichnis:

1. PCR (Testen) - Was ist die PCR-Technik?
2. PCR (Forschung) - Anwendung der PCR-Methode
3. PCR (Forschung) - Lyme-Borreliose
4. PCR (Forschung) - Ergebnisse. Können sie falsch positiv sein?
5. PCR (Forschung) - Ergebnisse. Können sie falsch negativ sein?

PCR (Polymerasekettenreaktion) ist die grundlegende Methode, die in genetischen und molekularen Labors verwendet wird. Es wurde 1983 von Kara Mullis entwickelt, die 1993 den Nobelpreis dafür erhielt.

Hören Sie, worum es bei der PCR-Testtechnik geht. Dies ist Material aus dem Zyklus LISTENING GOOD. Podcasts mit Tipps.

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PCR (Testen) - Was ist die PCR-Technik?

Der PCR-Test besteht aus einer Mehrfachamplifikation (normalerweise in 30 bis 40 Zyklen) eines spezifischen DNA-Fragments, z. B. von Genen, die für Borrelia-Proteine ​​kodieren, unter Verwendung des Polymeraseenzyms.

Dann werden spezielle molekulare Farbstoffe verwendet, um das amplifizierte DNA-Fragment sichtbar zu machen. Die PCR ist aufgrund der Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente eine ultraempfindliche Methode.

Bei der PCR-Methode werden DNA-Fragmente mit spezifischen Primerpaaren für eine bestimmte Region der bakteriellen DNA amplifiziert. Beispielsweise sind Zielregionen in der PCR, die bei der Diagnose der Lyme-Borreliose verwendet werden, Gene, die Proteine ​​codieren, z. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Das biologische Material, aus dem der Test durchgeführt werden kann, ist:

• Blut
• ein Hautabschnitt von einem wandernden Erythem
• Cerebrospinalflüssigkeit
• Synovialflüssigkeit oder aus Gelenkknorpel
• Urin

PCR (Forschung) - Anwendung der PCR-Methode

Neben der Diagnose der Lyme-Borreliose mittels PCR können spezifische DNA-Fragmente anderer Mikroorganismen oder Menschen nachgewiesen werden. Daher wird die PCR-Methode auch verwendet in:

• Diagnose und Überwachung von Virusinfektionen: Herpesviren (Herpesvirus, Herpes zoster, Epstein-Barr, Cytomegalovirus), HIV, Hepatitis-Viren (HBV und HCV)
• Diagnose und Überwachung von bakteriellen Infektionen, insbesondere von Bakterien, die nicht durch Kultur identifiziert werden können, z. B. Tuberkulose
• Diagnostik und Überwachung neoplastischer Erkrankungen: Leukämie, Brustkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs
• Diagnose der Krebsveranlagung: Brust- und Eierstockkrebs (BRCA1- und BRCA2-Gene), Darmkrebs (APC- und CHEK2-Gene)
• Diagnostik genetisch bedingter Krankheiten: Hämochromatose (HFE-Gen), Thalassämie (HBA1- und HBA2-Gene), Zöliakie (HLA-Gene)
• Vaterschaftstests, die die DNA-Kompatibilität von Kind und Vater nachweisen

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Derzeit gibt es viele Modifikationen an der PCR-Methode. Beispielsweise werden bei der Diagnose der Lyme-Borreliose hauptsächlich die Methoden der verschachtelten PCR und der Echtzeit-PCR verwendet. Letzteres ist eine quantitative Methode und ermöglicht die Bestimmung der genauen Anzahl von Borrelia-DNA-Kopien im getesteten biologischen Material.

PCR (Forschung) und Lyme-Borreliose

Serologische Tests sind die Grundlage für die Diagnose der Lyme-Borreliose. Es gibt jedoch klinische Situationen, die dazu führen können, dass diese Tests falsch negativ sind:

• serologisches Fenster, d. h. die anfängliche Infektionsperiode, in der der Körper noch keine spezifischen IgM- und IgG-Antikörper gegen Borrelia spirochetes produziert
• bei Menschen mit Immunschwäche, die nicht genügend Antikörper produzieren
• das Vorhandensein von Immunkomplexen, die aus Borrelia spirochetes-Antigenen und spezifischen Antikörpern für diese bestehen und den Nachweis von Antikörpern durch serologische Methoden verhindern

Wenn beim Patienten der Verdacht auf Lyme-Borreliose besteht und die serologischen Testergebnisse negativ sind, können molekulare Tests auf der Grundlage der PCR-Methode durchgeführt werden.

Die DNA von Borrelia spirochetes kann im frühen Stadium der Infektion nachgewiesen werden, da die Anzahl der Spirochäten in Körperflüssigkeiten dann am höchsten ist.

Bei der Diagnose der Lyme-Borreliose werden hauptsächlich serologische Methoden wie der ELISA verwendet. In einigen klinischen Situationen sind jedoch Gentests mit der PCR-Methode hilfreich.

Je länger die Zeit von der Infektion entfernt ist, desto weniger wahrscheinlich ist es, bakterielle DNA nachzuweisen. Daher werden in einigen Fällen vor Durchführung des PCR-Tests Bakterien 1-2 Wochen lang auf speziellen Medien gezüchtet, und dann wird der Test durchgeführt.

Dieser Ansatz wird bei Verdacht auf Lyme-Borreliose und geerntete Liquor cerebrospinalis angewendet. In der späten Phase der Infektion ist es besser, einen ELISA-Test durchzuführen.

Die PCR-Methode sollte bei der Routinediagnose der Lyme-Borreliose nicht angewendet werden, da keine Standardisierung hinsichtlich des Auftretens von Borrelia burgdorferi-Sorten in Polen vorliegt.

Bei diagnostischen Schwierigkeiten (insbesondere im Frühstadium der Erkrankung) hilft das Ergebnis des PCR-Tests jedoch im diagnostischen Prozess.

Ein positives Testergebnis bedeutet, dass das Vorhandensein von Borrelia burgdorferi-DNA und ihren Sorten im getesteten Material nachgewiesen wurde, erklärt jedoch nicht, ob eine aktive Infektion im Körper stattfindet. Andererseits schließt ein negatives Ergebnis das Vorhandensein von Bakterien im Körper nicht aus.

Einige Labors bieten Tests auf das Vorhandensein von Borrelia-DNA in der Zecke an. Das Ergebnis einer solchen Untersuchung ist jedoch nicht die Grundlage für die Diagnose der Lyme-Borreliose bei einer gebissenen Person.

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PCR - Ergebnisse. Können sie falsch positiv sein?

Die PCR ist eine hochempfindliche Methode und gleichzeitig sehr empfindlich gegenüber Kontaminationen. Daher ist es bei PCR-basierten Tests sehr wichtig, eine geeignete interne Kontrolle auszuwählen, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen.

Der Schlüssel ist auch die korrekte Sammlung von zu testendem Material sowie die Erfahrung und Zuverlässigkeit des Diagnostikers, der den Test durchführt.

PCR - Ergebnisse. Können sie falsch negativ sein?

Wie bei jedem Labortest können auch bei der PCR-Methode falsch negative Ergebnisse auftreten. Hier ist es wichtig, Blut für ein geeignetes Antikoagulans zu sammeln, da einige von ihnen, wie Heparin, die PCR-Reaktion hemmen können.

Auch das Sammeln von Material nach Beginn der Antibiotikatherapie kann zu einer Verringerung der Effizienz der PCR-Reaktion und zu einer höheren Wahrscheinlichkeit falsch negativer Ergebnisse führen.

Es ist auch zu beachten, dass Borrelia-Bakterien nur sehr kurze Zeit im Blut und in den Körperflüssigkeiten leben, da sie dank spezieller Rezeptoren sehr schnell in "schwer erreichbare" Stellen im Körper eindringen.

Daher ist im Gegensatz zur Diagnostik anderer Mikroorganismen die Anzahl der Borrelia spirochetes in biologischem Material gering, manchmal sogar an der Nachweisgrenze der PCR-Methode. Dies kann auch ein falsches Negativ verursachen.

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Literatur

1. Dunaj J. et al. Die Bedeutung der PCR-Methode für die Diagnose der Lyme-Borreliose. Durchsuche Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
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Über den Autor

Karolina Karabin, MD, PhD, Molekularbiologin, Labordiagnostikerin, Cambridge Diagnostics Polska Ausbildung zur Biologin mit Spezialisierung auf Mikrobiologie und Labordiagnostikerin mit über 10 Jahren Erfahrung in der Laborarbeit. Absolvent der School of Molecular Medicine und Mitglied der Polnischen Gesellschaft für Humangenetik. Leiter der Forschungsstipendien am Labor für Molekulare Diagnostik der Abteilung für Hämatologie, Onkologie und innere Krankheiten der Medizinischen Universität Warschau. Sie verteidigte den Titel eines Doktors der medizinischen Wissenschaften auf dem Gebiet der medizinischen Biologie an der 1. Medizinischen Fakultät der Medizinischen Universität Warschau. Autor zahlreicher wissenschaftlicher und populärwissenschaftlicher Arbeiten auf dem Gebiet der Labordiagnostik, Molekularbiologie und Ernährung. Als Spezialist auf dem Gebiet der Labordiagnostik leitet er täglich die inhaltliche Abteilung von Cambridge Diagnostics Polska und arbeitet mit einem Team von Diätassistenten der CD Dietary Clinic zusammen. Er teilt sein praktisches Wissen über Diagnostik und Ernährungstherapie von Krankheiten mit Spezialisten auf Konferenzen, Schulungen sowie in Magazinen und Websites. Ihr besonderes Interesse gilt dem Einfluss des modernen Lebensstils auf molekulare Prozesse im Körper.